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看酶标仪时间分辨荧光技术是如何实现的
更新时间:2016-08-15   点击次数:2056次
    酶标仪时间分辨荧光技术是以镧系元素作为标记物的一种免疫检测技术。其原理是镧系元素(如Eu3+)具有长寿命的发射荧光,标记待检测物质后,使用特定激发光激发,通过一定的检测时间延迟来达到扣除本底荧光的目的,并以此来提高信噪比与检测灵敏度。
酶标仪
时间分辨荧光(精度:10-18mol/L)与以下标记免疫技术相比:
优点:精度高
放射免疫(精度:10-12mol/L)早出现,发展成熟稳定性差,有危害,操作繁琐
酶联免疫(精度:10-9mol/L)安全灵敏度、重复性差
化学发光(精度:10-15mol/L)测定速度快、灵敏度高样品不能重复测定试剂稳定性差,试剂价格高
电化学发光(精度:10-17mol/L)本底较小、灵敏度较高非开放性试剂系统、不能做科研价格高
90年代以来,时间分辨荧光分析技术因其灵敏度高,操作简便,标准曲线范围宽,不受样品自然荧光干扰,无放射性污染等特点,其方法学研究和临床应用的发展十分迅速。
用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物,标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质
当反应体系发生后,如抗原抗体免疫反应、核酸探针杂交等反应,经解离—增强作用,用时间分辨荧光仪,测定后产物的荧光强度。
根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的.。
常规荧光免疫测定技术易受待测样品中非特异本底荧光的干扰,灵敏度受到一定限制。于是,20世纪80年代初,在常规荧光免疫分析的基础上发展了一种新型免疫分析技术——时间分辨荧光免疫测定(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)。其原理和方法与常规荧光免疫不同,所用标记物不是普通荧光物质,而是镧系稀土元素铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽(Tb3+)等[8],检测设备也不同于一般的荧光分光光度计,而是使用时间分辨荧光计测量排除样品中非特异荧光的干扰,极大地提高了测定方法的灵敏度[9]。TRFIA在灵敏度、特异性、稳定性及测量自动化程度等方面都可与放射免疫测定(RIA)相媲美,而其标准曲线范围宽(跨越4—5个数量级),小检出值可达10—18mol/L,分析速度快,远远超过RIA、EM及发光免疫测定,并具操作简便,无放射性污染,因此成为免疫分析中具发展潜力的一项技术[10]。TRFIA的基本原理是:将镧系元素铕(Eu3+)、钐(Sm3+)、铽(Tb3+)等通过具有双功能基团的螯合剂标记于抗体(或抗原)分子上。当标记抗体和待测抗原结合,采用紫外脉冲光(340nm,每秒闪烁1000次)进行激发,不仅发射出高强度的荧光(613nm),而且衰变时间也较长(10~1000us)。利用延缓测量时间,待短寿的本底荧光(样品池和待测样品中蛋白质等自然发生的非特异性荧光,衰变时间1—10ns)全部衰变后,再行测量,所得信号*为长寿命镧系元素螯合物的特异荧光,从而有效排除非特异本底荧光的干扰,大大提高分析的特异性和灵敏度。此外,Eu3+或Sm3+的激发光与发射光之间有很大的Stokes位移,而且激发光的光谱较宽,有利于增高激发能,增强标记物的比活性;且发射荧光的谱带很窄,有助于降低本底,从而提高分析的特异性和灵敏度。

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